離心機(jī)分離生物T淋巴細(xì)胞的技術(shù)

發(fā)布時(shí)間：

2011-12-28

概要：

原理混合單個(gè)核細(xì)胞懸液在通過尼龍毛柱時(shí)，B細(xì)胞、漿細(xì)胞、單核細(xì)胞和一些輔助細(xì)胞被選擇性粘附于尼龍毛上，而多數(shù)T細(xì)胞則通過尼龍毛柱，是獲得富含T細(xì)胞群的有效方法。

（一）原理混合單個(gè)核細(xì)胞懸液在通過尼龍毛柱時(shí)，B細(xì)胞、漿細(xì)胞、單核細(xì)胞和一些輔助細(xì)胞被選擇性粘附于尼龍毛上，而多數(shù)T細(xì)胞則通過尼龍毛柱，是獲得富含T細(xì)胞群的有效方法。

（二）材料及試劑

1．尼龍毛（Femwall Laboratories,LP－1 Leukoqak leukocyte Filters）。
2．燒杯、鋁箔、漏斗、一次性手套等。
3．裝填尼龍毛柱，一次性注射器。
4．取自然沉降的上層血漿，過聚蔗糖—泛影葡胺分層液后，獲取的血漿和分層液之間的單個(gè)核細(xì)胞層。

（三）操作方法

1．尼龍毛的清洗與干燥

（1）戴上已經(jīng)洗去滑石粉的一次性手套，將尼龍毛（1包或2包，每包35g）放入燒杯中，加入蒸餾水或去離子水，用鋁箔蓋上燒杯并煮沸約10min。
（2）冷卻至常溫，倒入漏斗內(nèi)，使水滴干。
（3）重復(fù)（1）、（2）步驟6次。
（4）將尼龍毛攤在鋪有紗布的方盤內(nèi)，37℃溫箱干燥2～3天后，貯藏在帶蓋的方盤內(nèi)。

2．裝尼龍毛柱

（1）取50ml玻璃注射器，拔去注射芯，在注射器頭上套一段帶夾子的膠管。
（2）將尼龍毛梳理，并適當(dāng)折疊，以適應(yīng)注射器的直徑，填入注射器內(nèi)，約20ml的體積。
（3）將填好尼龍毛的注射器連同注射器芯一起包好，高壓滅菌。

3．細(xì)胞分離

（1）將注射器固定在支架上，倒入37℃的細(xì)胞培養(yǎng)液，關(guān)閉閥門一定時(shí)間，然后打開閥門，放掉細(xì)胞培養(yǎng)液，以清洗幾次尼龍毛，關(guān)上閥門。
（2）將要分離的細(xì)胞液用預(yù)先加溫的培養(yǎng)液稀釋成適當(dāng)?shù)臐舛龋s5.00×107個(gè)細(xì)胞／ml。
（3）將細(xì)胞液倒入注射器內(nèi)，使之沒過尼龍毛柱。蓋上注射器，37℃溫育45min 至1h。
（4）打開下口，緩慢放流（1滴／min），收集于離心管中。（5）離心，即獲所需的T淋巴細(xì)胞。
（6）關(guān)閉注射器下口，于注射器內(nèi)加入0.85％冰冷生理鹽水，振蕩，并套上注射器芯，打開下口，使勁推出注射器內(nèi)液體，即獲得粘附于尼龍毛上的B淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等。

（四）注意事項(xiàng)

1．此種分離法，T淋巴細(xì)胞也常有一部分被吸附，吸附的多少與尼龍毛的質(zhì)量有關(guān)，與裝柱的松緊也有關(guān)系。
2．此法的T淋巴細(xì)胞的回收率約20％～30％。
3．用過的尼龍毛可回收，以鹽水洗滌，然后浸入0.1Mol/L的HCl中過夜，然后再同前法清洗。單核細(xì)胞分離技術(shù)

（一）鐵粉吸附法

1．材料及試劑

（1）鐵粉或羰基鐵粉（Atomergic chemetals）99％的純度，顆粒小于60µm（Goodfellow Metals）。
（2）強(qiáng)磁鐵（馬蹄形）。
（3）一塊小棒狀磁鐵（約1cm長(zhǎng)）。
（4）毛細(xì)吸管等。

2．操作方法

（1）稱取一定量的鐵粉，一般為10g，用100ml生理鹽水洗滌4次，去除任何可溶性有毒物質(zhì)。在倒去鹽水時(shí)，用強(qiáng)磁鐵吸住鐵粉。
（2）用50ml生理鹽水混懸鐵粉。搖勻后，分裝于10個(gè)瓶中，包扎瓶口，121℃滅菌20min，拿出后立即輕輕搖勻，防止鐵粉結(jié)塊，儲(chǔ)藏備用。
（3）臨用前，倒去瓶中的生理鹽水，加入適量的單個(gè)核細(xì)胞懸液（3ml～5ml，細(xì)胞總數(shù)為8×107個(gè)／瓶）。37℃溫育45min，中間不時(shí)晃動(dòng)，使鐵粉懸浮起來。
（4）加入一塊小磁鐵棒于瓶中，讓其吸住鐵粉以及附著在鐵粉上的細(xì)胞。
（5）倒出懸液，此懸液主要是淋巴細(xì)胞，離心，收集。
（6）在鐵粉瓶?jī)?nèi)倒入一定量的Hank’s液，用力振搖后，以強(qiáng)磁鐵吸附，幾分鐘后，倒出液體。
（7）2 000r/min離心液體，管底即為單核細(xì)胞。

（二）玻璃板吸附法將分離的單個(gè)核細(xì)胞傾于無菌潔凈的玻璃平皿內(nèi)，置37℃ 30 min～40min，用毛細(xì)吸管輕輕吸取懸液，即為淋巴細(xì)胞。用適量的Hank’s液沖洗平皿，收獲即為單核細(xì)胞懸液。

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